蛋白纯化步骤_蛋白纯化的三种新工具
蛋白亲和标签是蛋白质组研究中的一个关键性工具，迄今为止人们已经开发出了许多久经考验的蛋白标签系统，例如六聚组氨酸、HA、Myc和FLAG等等。尽管这些标签系统各具特色，但它们也分别存在着一些缺陷，还不能完全满足研究者们的需要。
为此，Biotechniques杂志盘点了近期出现的三种新蛋白标签系统，以便为研究者们提供更大的选择空间。这三种蛋白标签系统分别利用了高亲和力单抗、无机矿物基质、以及能够剪切标签的金属离子。（推荐阅读：2013年蛋白质分析文章精选）
单克隆抗体标签
日本研究者Yukinari Kato在开发胶质母细胞瘤的治疗性抗体时，无意中发现了一个可用作亲和标签的肽段。Podoplanin蛋白是一个在恶性癌细胞中高度表达的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠单克隆抗体NZ-1可以靶向该蛋白中一个14个残基的肽段。Kato在ELISA实验中注意到，NZ-1与podoplanin蛋白的亲和力特别高，于是他与大阪大学的Junichi Takagi合作，希望将其开发成为一个蛋白标签系统。
研究人员将与NZ-1结合的podoplanin肽段称为PA标签，并将其与现有的其他标签系统进行比较（FLAG、HA和Myc）。他们发现，NZ-1和PA标签之间的亲和力更高，解离更慢。Takagi尝试用这一系统来分离，哺乳动物细胞分泌到培养基中的重组蛋白。这些重组蛋白的初始浓度较低，比较难于分离和纯化。
研究人员发现，细胞培养液上清中的PA标记蛋白，能够有效结合NZ-1-琼脂糖。此外，0.1 mg/ml的PA标签溶液可以将融合蛋白竞争性的洗脱下来。随后，Takagi又通过NZ-1-琼脂糖层析纯化了15种不同分子量的分泌蛋白，这些蛋白的纯度都超过了95%。
据介绍，这一系统的关键优势在于，可以在无损抗体柱的情况下很方便的进行再生。研究显示，高盐缓冲液可以完全去除结合在抗体上的PA标签，进行60次结合-洗脱-再生的循环，也不会对柱子的结合能力产生任何影响。
目前，上述系统还不能兼容人类细胞。“我们正在晶体结构的引导下，设计不识别人类podoplanin的改进版NZ-1，只保留它与标签肽段的高亲和力，”Takagi说。他现在正努力将这一标签系统应用到蛋白质组分析中去，希望能够用其替代FLAG标签。
磷灰石基质
人们常常用固化的抗体和金属离子来纯化重组蛋白，不过这些方案并不完美，存在着金属离子析出、稳定性低、和成本高等问题。为此。Jacobs大学的Marcelo Fernandez-Lahore用无机矿物氟磷灰石，开发了一个新的亲和标签纯化系统。
以磷酸钙为基础的磷灰石（例如羟磷灰石和氟磷灰石），几十年来一直被用作生物分子的吸附剂，其优势在于这种物质既没有抗原性也没有细胞毒性。然而，人们一直未能将它们用于层析法蛋白纯化。这是因为此前的磷灰石基质“颗粒形状不规则，而且在某些条件下很容易溶解，”Fernandez-Lahore说。而近期商业化的CFT珠（macroporous ceramic fluorapatite）解决了上述问题。
Fernandez-Lahore实验室在这种材料的基础上，开始寻找与氟磷灰石高度亲和的标签肽段。研究人员通过噬菌体展示筛选，发现肽段KPRSVSG与CFT的结合能力很强，于是他们决定将这个CFT结合肽段（CBP）开发成为蛋白纯化的亲和标签。
本文来源：https://www.oubohk.cn/shengwu/350051/
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