薄层色谱法规范操作_薄层色谱法

　　色谱法（又称层析法），是一种物理的分离方法。色谱法总有两个相，一个固定相和一个流动相，因为流动相的流动以及各成分在两相中的性质的差别而得到分离。薄层色谱法，是色谱法中应用最普遍的方法之一，其特点：分离速度快、效率高、适用性强、操作简便。在植物成分研究、生物化学、药物化学、卫生化学、毒物检验中广泛用来分离、精制和鉴定化学物质等。

　　二、色谱法分类

　　(一). 按分离原理分

　　1.吸附色谱法：利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱使各组份得到分离；常用吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。

　　2.分配色谱法：利用被分离物质在两相中分配系数的不同使各组份得到分离；其中一相被涂布或键合在固体载体上，称固定相，另一相为液体或气体，称流动相；常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。

　　3.离子交换色谱法：利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同，使各组份得到分离；常用的离子交换树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水或含有有机溶剂的缓冲液。

　　4.排阻色谱法：分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同，使各组份得到分离；常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。

　　(二).按分离方法分

　　1. 柱色谱法  分吸附柱色谱和分配柱色谱两类。吸附柱色谱中吸附剂颗粒通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒，尽可能保持大小均匀，柱长一般为30－100cm或大于100cm。适用于分离或精制较大量的样品，多组份分离。但整个分离过程需要几小时甚至几天才能完成。

　　2. 薄层色谱法  原理上属吸附层析法。以玻璃板、塑料板或铝基片为载体，在载体上涂布均匀的固定相，把要分析或分离的样品点在薄层板上，用展开剂展开，再用显色剂显色的分配色谱。将要分离的混合物点在用固定相均匀涂布的薄层板上，用适当的展开剂在密闭的层析缸中展开，被分离的组分不随展开剂流动，而是选择性地保留在原点和溶剂前沿之间，被分离的化合物在薄层板上的位置用比移值（Rf）表示，Rf=0，表示样品留在原点，Rf=1，表示样品不被保留，置紫外灯下或直接喷显色剂即可观察。优点：操作、显色比较方便，薄层色谱法斑点集中，薄层板耐腐蚀。

　　3. 纸色谱法  以纸为载体,以纸上所含水分或其它物质为固定相，用展开剂展开的分配色谱。可用比移值（Rf）表示各组份的位置。操作分上行法和下行法两种。优点：操作、显色比较方便，以纸为支持剂，没有薄层色谱法铺层的麻烦；缺点：不能用腐蚀性显色剂，分离效果不如薄层色谱法斑点集中。

　　4. 气相色谱法  气相色谱法流动相为气体（载气），色谱柱内装吸附剂、高分子多孔小球或涂有固定液的载体。注入进样口的供试品被加热气化，被载气带入色谱柱内分离后，各组份先后进入检测器，用记录仪记录色谱图。操作形式上属于柱色谱法，按原理可分为吸附及分配色谱。优点：高效能、高选择性、高灵敏度、用量少、分析速度快、并可制备高纯物质。

　　5. 液相色谱法  液相色谱法流动相为液体，使用较细的色谱柱（直径1－4mm），使用5－40um颗粒的吸附剂，在洗脱溶剂上加高压，得到较好的流速和较快的分离。洗脱液通过检测系统得到组分的色谱图和计算各组分峰面积。优点：高效能、高选择性、高灵敏度、用量少、分析速度快、并可制备高纯物质。

　　三、薄层色谱法的原理

　　基本原理是利用混合物中各组份的物理化学性质的差别，在层析过程中，在不相溶的两个相中分布的不同，达到分离目的。这两个相，一个是涂布在薄层板上的吸附剂，叫固定相，另一个是在展开过程中流过固定相的展开剂（有机溶剂），叫流动相。将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开，由于吸附剂对混合物中不同物质的吸附力大小不同，对极性大的物质吸附力强，对极性小的物质吸附力弱。因此当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。宜被吸附的物质（极性大、被附力作用强的物质）相对移动较慢，在薄层板上移动的距离就小；反之，较难被吸附的物质（极性小、被附力作用弱的物质）相对移动较快一些，在薄层板上移动的距离则大。经过一段时间的展开，混合物中各组份在薄层板上连续不断地进行吸附和解吸附过程，从而使各组份移动的速度产生差异，不同物质就被彼此被分开，最后形成互相分离的斑点。

　　四、薄层色谱法优点

　　1. 展开时间短，一般十至几十分钟；

　　2. 分离能力强，斑点集中；

　　3. 灵敏度高，通常几至几十微克的物质即可被检出；

　　4.显色方便，可直接喷洒腐蚀性的显色剂，如浓硫酸等；

　　5.所用仪器简单，操作方便，可以普及；

　　6.薄层板价格低廉，一块板可同时检测多个样品；

　　7.色谱直观性强。

　　五、薄层色谱法的应用

　　1. 用于药品和制剂的质量控制及杂质检查

　　2. 控制化学反应进程，反应副产物的检查及中间体的分析

　　3. 探索柱色谱的分离条件

　　4. 精制和制备纯品的药物

　　5. 临床和生化检验

　　6. 毒物分析

　　7.中药成分分析和含量测定

　　8.中药材品种真伪检查及其代用品寻找

　　9.其它微量鉴定和分析

　　六、薄层色谱分析的实验器材及其基本操作

　　(一).实验器材及试剂

　　1. 器材

　　(1). 玻璃板：10×10cm、10×20cm、5×20cm、20×20cm等。表面及四边要求光滑、平整（四角均为直角）、薄厚均匀、质地均匀。洗净后不应附水珠，于无尘处晾干，不应有斑痕，备用。必要时用前用酒精棉球擦净晾干。

　　(2). 铺板器：能使吸附剂在载体(玻璃板)上铺成一层厚度符合要求的平整、均匀的薄层。分自动铺板器和手动铺板器两种。手动铺板器包括铺板架和涂布器，涂布器用金属或有机玻璃均可，规格有0.2-1.0mm不等。

　　(3). 干燥箱：温度易于调控，用于活化薄层板。

　　(4). 干燥板架：用于放置铺好的薄层板，进行烘烤或贮存。

　　(5). 干燥器：用于放置活化后的薄层板。

　　(6). 点样器：定量毛细管或微量注射器，内径一般为1mm，末端平整、光滑，或经标化的毛细管均可，要求能使点样位置正确、集中、原点平整无凹陷。

　　(7). 层析缸：要求密闭、地部平整，以双槽层析缸为佳，双槽层析缸具有节省溶剂及方便预饱和等优点。

　　(8). 喷雾器：不受试剂腐蚀并能使显色剂呈细而均匀的雾状喷出。

　　(9). 紫外光灯：254nm、365nm。

　　2.吸附剂

　　(1). 最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、硅胶GF254＋365等；

　　(2). 其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等；

　　(3). 吸附剂颗粒大小，一般要求直径为10－40um；

　　(4). 薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种，前者系将固定相直接涂布在载体上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10－15％煅石膏（CaSO4•2H2O在140℃烘4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5-0.7%）适量调成糊状，涂布。

　　3.试剂

　　(1). 样品处理用

　　一般为分析纯，按样品稀释要求处理。

　　(2). 配制展开系统用

　　分析纯，不能与被分离物发生化学反应。

　　(二).实验操作程序及其基本技术

　　1.薄层板的制备：分软板和硬板两种。铺板，一般取一份吸附剂加两份水，研磨调成糊状，涂布，厚度一般为0.3-0.5nm，一块5×20cm板约需3g吸附剂。室温下晾干，于105－110℃活化0.5-1小时，置干燥器内备用，1周内可使用，超出1周，用前需再次活化，不主张反复活化，长期使用。

　　2.供试品溶液的制备：按规定的方法制备。

　　3.对照品溶液及对照药材溶液的制备：按规定的方法制备。

　　4.点样

　　(1). 直接点样法：点样量一般不超过10ul，点样时不要损伤薄层板表面，宜分次点加，直径不要超过4mm，点样基线距底边为1.0-1.5cm，距两边不少于1.0cm，两个样点距离可视斑点扩散以不影响检出为宜，一般为1.5-2.0cm，点样基线与薄层板地边平行。

　　(2). 滤纸移样法：薄层板上打孔，另取大小相同的滤纸，置针尖上，点样，将滤纸置挖好的小孔上，要求吻合良好。

　　5.展开剂的制备：按比例配制，现配现用。

　　6.层析缸的饱和：为使Rf值重现性良好，展开剂置于层析缸中，缸壁贴上两条高、宽适宜的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，室温放置1小时左右，俟展开剂挥发，使系统平衡。

　　7.薄层板的预饱和：克服边缘效应以及改善分离效果，Rf值重现性良好。

　　8.展开：水平展开和垂直展开，浸入深度距底边0.5－1.0cm，距原点5mm为宜，切勿将样点浸入展开剂中，展距以7－15cm为宜，展距过大，斑点扩散，精确度差，展距过小，分离效果差。

　　9.显色

　　(1). 蒸气显色法：常用挥发性的酸、碱如盐酸、硝酸、浓氨、二乙胺等蒸气显色。

　　(2). 试剂显色法：常用喷雾法或浸渍法处理，显色试剂常用硫酸、碘的氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液、磷钼酸等。

　　10.色谱的检视

　　(1). 有色物质：日光下直接观察或在紫外灯下观察荧光斑点。

　　(2). 无色物质：1）在紫外灯下（指定波长）下观察化合物本身不同颜色的暗斑或荧光斑点，或显色后按有色物质进行检视；2）在可见光、紫外光下均不显示，也没有合适的显色方法的物质，可在紫外光灯254nm下观察荧光薄层板上黄色荧光背景上的紫蓝色斑点，这是由于化合物减弱了吸附剂中荧光物质的紫外吸收强度引起了荧光的熄灭所致。

　　(三).薄层色谱法的记录内容

　　1. 实验日期

　　2. 供试品及对照品、对照药材的名称及来源

　　3. 供试品溶液及对照品溶液、对照药材溶液的制备方法及浓度

　　4. 薄层板吸附剂的类型及薄层板的制备方法

　　5. 点样量（ul）

　　6. 展开系统

　　7. 展开方式及展距

　　8. 展开时的室温及相对湿度

　　9. 显色方法

　　10. 检视结果

　　(1). 绘制薄层色谱图：照片、示意图或复制图等。

　　(2). 色谱图与对照品比较并加以说明

　　(3). 计算并记录Rf值，说明主斑点为何物